生物柴油的化學法生產是采用生物油脂與甲醇或乙醇等低碳醇，并使用氫氧化鈉 (占油脂重量的1%) 或甲醇鈉 (Sodium methoxide) 做為觸媒，在酸性或者堿性催化劑和高溫（230～250℃）下發生酯交換反應（transesterification），生成相應的脂肪酸甲酯或乙酯，再經洗滌干燥即得生物柴油。甲醇或乙醇在生產過程中可循環使用，生產設備與一般制油設備相同，生產過程中產生10%左右的副產品甘油。 　　

但化學法合成生物柴油有以下缺點：反應溫度較高、工藝復雜；反應過程中使用過量的甲醇，后續工藝必須有相應的醇回收裝置，處理過程繁復、能耗高；油脂原料中的水和游離脂肪酸會嚴重影響生物柴油得率及質量；產品純化復雜，酯化產物難于回收；反應生成的副產物難于去除，而且使用酸堿催化劑產生大量的廢水，廢堿（酸）液排放容易對環境造成二次污染等。 　　

化學法生產還有一個不容忽視的成本問題：生產過程中使用堿性催化劑要求原料必須是毛油，比如未經提煉的菜籽油和豆油，原料成本就占總成本的75%。因此采用廉價原料及提高轉化從而降低成本是生物柴油能否實用化的關鍵，因此美國己開始通過基因工程方法研究高油含量的植物（見下文“工程微藻”法），日本采用工業廢油和廢煎炸油，歐洲是在不適合種植糧食的土地上種植富油脂的農作物。