為解決上述問題，人們開始研究用生物酶法合成生物柴油，即用動物油脂和低碳醇通過脂肪酶進行轉酯化反應，制備相應的脂肪酸甲酯及乙酯。酶法合成生物柴油具有條件溫和、醇用量小、無污染排放的優點。2001年日本采用固定化Rhizopus oryzae細胞生產生物柴油，轉化率在80％左右，微生物細胞可連續使用430小時。 　　

2005年6月4日，《中國環境報》報道：清華大學生物酶法制生物柴油中試成功，采用新工藝在中試裝置上生物柴油產率達90％以上。中試產品技術指標符合美國及德國的生物柴油標準，并滿足我國0號優等柴油標準。中試產品經發動機臺架對比試驗表明，與市售石化柴油相比，采用含20％生物柴油的混配柴油作燃料，發動機排放尾氣中一氧化碳、碳氫化合物、煙度等主要有毒成分的濃度顯著下降，發動機動力特性等基本不變。

由于利用物酶法合成生物柴油具有反應條件溫和、醇用量小、無污染物排放等優點，具有環境友好性，因而日益受到人們的重視。但利用生物酶法制備生物柴油目前存在著一些亟待解決的問題：脂肪酶對長鏈脂肪醇的酯化或轉酯化有效，而對短鏈脂肪醇(如甲醇或乙醇等)轉化率低，一般僅為40%-60%；甲醇和乙醇對酶有一定的毒性，容易使酶失活；副產物甘油和水難以回收，不但對產物形成一致，而且甘油也對酶有毒性；短鏈脂肪醇和甘油的存在都影響酶的反應活性及穩定性，使固化酶的使用壽命大大縮短。這些問題是生物酶法工業化生產生物柴油的主要瓶頸。